柱層析心得 

常說(shuō)的過(guò)柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由于柱分離的經(jīng)驗(yàn)成分太多，所以下面我就幾年來(lái)過(guò)柱的體會(huì)寫(xiě)些心得，希望能有所幫助。 1．吸附劑    

    常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣和活性炭等：吸附劑一般要經(jīng)過(guò)純化和活性處理，顆粒大小應(yīng)當(dāng)均勻。對(duì)吸附劑來(lái)說(shuō)粒子小、表面積大，吸附能力就高，但是顆粒小時(shí)，溶劑的流速就太慢，因此應(yīng)根據(jù)實(shí)際分離需要而定。供柱色譜使用的氧化鋁有酸性、中性和堿性3種。酸性氧化鋁是用1％鹽酸浸泡后，用蒸餾水洗**氧化鋁的懸浮液pH為4，用于分離酸性物質(zhì)；中性氧化鋁的pH約為7．5，用于分離中性物質(zhì)；堿性氧化鋁的pH約為10，用于胺或其它堿性化合物的分離。 

  因硅膠略帶酸性，只能用于對(duì)酸不敏感的化合物的分離。常用300-400目的柱硅膠或H硅膠。若化合物的Rf值相差較大，則可考慮使用２00-３00目硅膠以加快層析速度。         另：因吸附劑的比表面較大，天氣潮濕時(shí)或長(zhǎng)期放置中吸附的水分會(huì)對(duì)分離效果產(chǎn)生極大的影響（相當(dāng)于大大增加了固定相的極性導(dǎo)致樣品分不開(kāi)），因此應(yīng)將吸附劑放入９０～１００度烘箱內(nèi)烘２小時(shí)后，取出在干燥器中冷卻后再使用。使用的硅膠，不用時(shí)一定要密封，防止吸潮。TLC所用的硅膠板一定要保存在干燥器里面，或使用前在紅外烘箱里干燥一段時(shí)間。 

2．溶質(zhì)的結(jié)構(gòu)與吸附能力的關(guān)系      

    化合物的吸附性與它們的極性成正比，化合物分子中含有極性較大的基團(tuán)時(shí)，吸附性也較強(qiáng)，氧化鋁對(duì)各種化合物的吸附性按以下次序遞減：  

    酸和堿>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>鹵代物、醚>烯>飽和烴   3．柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。 

    壓力可以增加淋洗劑的流動(dòng)速度，減少產(chǎn)品收集的時(shí)間，但是會(huì)減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時(shí)候，常壓柱是效率**高的，但是時(shí)間也**長(zhǎng)，比如天然化合物的分離，一個(gè)柱子幾個(gè)月也是有的。 

    加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過(guò)外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球是常用的手動(dòng)加壓的方法。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過(guò)大，不然溶劑走的太快就會(huì)減低分離效果。個(gè)人覺(jué)得加壓柱在普通的有機(jī)化合物的分離中是比較適用的。 

  體會(huì)：過(guò)柱時(shí)是否加壓要具體分析，通常情況下直徑比較粗的柱子用常壓即可，因其橫截面積的緣故淋洗劑的流速已足夠快。通常控制柱子下端液體流速大約在0.5~1滴每秒的范圍比較合適。 

減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺(jué)能夠節(jié)省一半甚**更多，但是由于大量的空氣通過(guò)硅膠會(huì)使溶劑揮發(fā)（有時(shí)在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時(shí)使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時(shí)間長(zhǎng)）。一般不推薦使用。 4. 柱子的尺寸 

    從理論上講應(yīng)該是粗長(zhǎng)的好。柱子長(zhǎng)了，相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點(diǎn)就小（反映在柱子上就是樣品層比較薄），這樣相對(duì)的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當(dāng)然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過(guò)這些成本相對(duì)于產(chǎn)品來(lái)說(shuō)也許就不算什么了。 

現(xiàn)在見(jiàn)到的柱子徑高比一般在1：5～10，書(shū)中寫(xiě)硅膠量是樣品量的30～40倍，若需要時(shí)可增**100倍，具體選擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開(kāi)（是指在所需組分Rf在0.2～0.4，雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺(jué)得可以增加柱子的長(zhǎng)度，也可以減小淋洗劑的極性等等。 

細(xì)長(zhǎng)柱子可以增加塔板數(shù)，但是也會(huì)增加過(guò)柱的時(shí)間使樣品在固定相中擴(kuò)散影響分離效果。 5．溶劑     

    溶劑的選擇是重要的一環(huán)，通常根據(jù)被分離物中各種成分的極性、溶解度和吸附劑的活性等來(lái)考慮先將要分離的樣品溶于一定體積的溶劑中，選用的溶劑極性應(yīng)低，體積要小。如有的樣品在極性低的溶劑中溶解度很小，則可加入少量極性較大的溶劑，使溶液體積不致太大。樣品的展開(kāi)shou先使用極性較小的溶劑，使**容易脫附的組分分離。然后加入不同比例的極性溶劑配成的洗脫劑，將極性較大的化合物白色譜柱中洗脫下來(lái)。常用洗脫劑的極性按如下次序遞增： 

己烷和石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<**<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸 

常選用石油醚，乙酸乙酯。正己烷價(jià)格比較高。使用**、二氯甲烷等沸點(diǎn)較低的溶劑時(shí)，它和硅膠的吸附是一個(gè)放熱過(guò)程，特別是夏天的時(shí)候經(jīng)常會(huì)在柱子里產(chǎn)生氣泡，天氣冷的時(shí)候會(huì)好一些。由于硅膠中的活性羥基，用甲醇可能會(huì)洗下來(lái)一些硅膠中的東西，所以產(chǎn)品如果想過(guò)元素分析的話要留神，應(yīng)該經(jīng)過(guò)后繼處理，比如說(shuō)重結(jié)晶等。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

展開(kāi)劑的比例要靠嘗試.一般根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的該類化合物用什么樣的展開(kāi)劑，就shou先嘗試使用該類展開(kāi)劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個(gè)分離效果好的展開(kāi)劑。很多時(shí)候,展開(kāi)劑的選擇要靠自己不斷變換展開(kāi)劑的組成來(lái)達(dá)到**佳效果。 

體會(huì)：１）過(guò)柱的淋洗劑極性通常要比過(guò)板時(shí)極性要小。一般為了得到更好的分離，通常是要把樣品的Rf值調(diào)到0.2-0.3之間，不過(guò)，許多情況下，如果接受瓶小一些，即使Rf值在0.5，0.6。 

   ２）盡量避免使用毒性較大的溶劑，如氯仿，可考慮用石油醚與乙酸乙酯調(diào)配。    ３）當(dāng)混合溶劑作為淋洗劑時(shí)，要考慮所用溶劑的沸點(diǎn)差異在使用過(guò)程中揮發(fā)程度不一樣而造成的極性改變。 

   ４）對(duì)于Rf值接近的化合物分離，可嘗試極性相近但由不同溶劑組成的混合體系作為淋洗劑可能會(huì)產(chǎn)生意想不到的效果。例如石油醚:乙酸乙酯＝５０:１與石油醚:二氯甲烷＝５:１的極性相近（僅是例子，具體比例有些忘了）的極性差不多，但是后者的分離效果可能優(yōu)于前者。 6．裝柱 

  柱子下面的活塞一定不要涂潤(rùn)滑劑，會(huì)被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟節(jié)門(mén)的。裝柱可采用濕法和干法兩種，二者各有優(yōu)劣。無(wú)論采用哪種方法裝柱，硅膠（固定相）的上表面一定要平整，并且都不要有裂縫或氣泡，雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺(jué)，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時(shí)候，氣泡就會(huì)釋放出來(lái)，嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)柱子變花，導(dǎo)致柱子開(kāi)裂，樣品不可能平整地通過(guò)，當(dāng)然也就談不上分離了。  濕法裝柱：關(guān)閉柱子下端活塞，把硅膠用適量的溶劑拌成半透明狀的均勻稀糊（更像是湯），此時(shí)應(yīng)充分?jǐn)嚢瑁屑?xì)觀察沒(méi)有氣泡后，以玻璃棒引流倒入事先裝有少量溶劑的空柱子中，然后打開(kāi)活塞讓溶劑流出，硅膠自然沉降。注意：１）裝柱溶劑極性不大于過(guò)柱淋洗劑；２）倒入硅膠稀糊應(yīng)有耐心防止液體流擊出氣泡留于柱內(nèi)；３）過(guò)程中若已產(chǎn)生氣泡，則可趁著硅膠尚未完全沉降時(shí)用長(zhǎng)玻棒攪動(dòng)溶劑液面下的有氣泡處的硅膠可將其趕跑。待硅膠**所需高度后另加溶劑加壓走柱，注意硅膠柱上方應(yīng)時(shí)刻保留有一段溶劑！本法**大的優(yōu)點(diǎn)是一般柱子裝的比較結(jié)實(shí)，沒(méi)有氣泡。缺點(diǎn)是所須溶劑體積較大（當(dāng)然裝柱時(shí)用溶劑可以重復(fù)使用），耗時(shí)長(zhǎng)。一般說(shuō)來(lái)濕法裝柱較干法緊密均勻，建議初學(xué)者采用。 干法裝柱：是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)，**硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠**合適高度，再用水泵在柱子下端直接抽，當(dāng)硅膠不再下落時(shí)，保持水泵抽氣狀態(tài)下，從柱子上倒入溶劑，注意倒入的溶劑流量必須大于水泵抽氣流量以保證柱子上方時(shí)刻保留一段溶劑！待溶劑前沿走到活塞時(shí)關(guān)閉活塞，注意此時(shí)因柱內(nèi)負(fù)壓溶劑仍在飛快往下走千萬(wàn)別讓柱子干了！撤走水泵，待柱內(nèi)液面不再下降，此時(shí)柱子的下半部分是均勻的而上半部分可以看見(jiàn)有氣泡，打開(kāi)活塞，倒入足夠的溶劑后從上端用剪去緩沖球的雙連球（即直接鼓氣）加壓，可將上半部分壓均勻無(wú)氣泡。若想柱子裝得緊密些，可用淋洗劑多走幾次柱子。本法的優(yōu)點(diǎn)是裝柱較方便，速度快，特別是裝體積較大的柱子特別能顯示時(shí)間優(yōu)勢(shì)（當(dāng)然大柱子因?yàn)槿軇┳叩锰烊菀壮楦伤詫?duì)技術(shù)的熟練程度要求更高些）。**大的缺陷在于抽氣時(shí)，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺(jué)到），不太適合低沸點(diǎn)的淋洗劑如**，二氯甲烷（易產(chǎn)生氣泡）。解決的辦法是：**、硅膠一定要壓結(jié)實(shí)；第二、一定要用較多的溶劑“走柱子”，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。 

不論用濕法或干法裝柱，若**后裝好時(shí)硅膠表面不平整，可用干凈玻棒將**上面約１厘米的硅膠重新?lián)v松，待其自然降落后，再加點(diǎn)溶劑壓緊即可。 ７．上樣 

樣品上樣分濕法、干法兩種。上樣的基本要求是使樣品以盡可能小的厚度上到柱子上，采用哪種方法應(yīng)根據(jù)樣品的實(shí)際情況而定，無(wú)論哪種都要求樣品中不含大于淋洗劑極性的溶劑。 

濕法上樣：適合濕法的樣品應(yīng)該是粘度不大均勻液體樣品或者在小極性溶劑（極性不大于淋洗劑）中溶解度非常好的固體樣品（保證上樣過(guò)程中不會(huì)析出）。用于溶解樣品的溶劑體積應(yīng)越少越好。打開(kāi)活塞，控制柱子上方溶劑恰好流干時(shí)關(guān)閉活塞，即用滴管吸取樣品，沿柱子內(nèi)壁于硅膠面上方0.5cm以內(nèi)距離均勻地加樣，待樣品布滿硅膠面后打開(kāi)活塞，繼續(xù)加樣。加樣的速度以柱子不出現(xiàn)氣泡為限。待所有樣品上完后，用盡可能少的溶劑洗劑樣品瓶，待樣品在硅膠上恰好走干后依上樣法將溶液加到硅膠上。（若樣品量比較大則可省去該步）。另取干凈滴管從上樣處上方沿柱子內(nèi)壁淋洗，確定所有樣品開(kāi)始在柱子中展開(kāi)后可加入大量溶劑開(kāi)始過(guò)柱。若擔(dān)心上樣及加溶劑過(guò)程中會(huì)將柱子表面弄破可考慮在上樣前先在柱子上加一層石英砂。過(guò)程中時(shí)刻保持柱子不要干出氣泡或裂紋！ 

很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒(méi)關(guān)系，仍可用濕法。可是有的上樣后在硅膠上又會(huì)析出，這時(shí)候建議采用干法上樣。 

干法上樣：干法就是把待分離的樣品用少量低沸點(diǎn)大極性溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑，注意必須在油泵上完全抽干大極性溶劑！如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層，注意保留足夠的溶劑使加入的干粉恰好能被覆蓋以防柱子開(kāi)裂（溶劑太多也不好，相當(dāng)于增加了上樣厚度）。此時(shí)加入的干粉層中可能會(huì)有大量的氣泡，但由于是松的，可以用玻棒稍做攪拌以除去氣泡，同樣要保持硅膠表面的平整。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF,DMSO等，會(huì)隨著溶劑一起顯色是一個(gè)很長(zhǎng)的脫尾，這些溶劑雖溶解性好，但是沸點(diǎn)太高不易除去應(yīng)避免），這時(shí)就必須用干法上柱了。 

用于吸附上樣的硅膠要求：１）樣品和硅膠的量比例問(wèn)題：應(yīng)盡可能地少用硅膠，可先按1：2嘗試，保證在旋干后固體是均勻的，不能看到有樣品顆粒析出（那說(shuō)明有的樣品沒(méi)有吸附在硅膠上）。若有，則應(yīng)重新用溶劑溶解后再加入硅膠重新抽干。２）硅膠顆粒通常要比作為固定相的大，以保證能盡快脫附降低上樣厚度。 

也可以在硅膠的**上層填上一小層石英砂或蓋張濾紙或加塊棉花，防止添加溶劑的時(shí)候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺(jué)是如果小心上樣，添加溶劑，可以什么都不用。 8. 樣品的收集 

用硅膠作固定相過(guò)柱子的原理是一個(gè)吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與硅膠的吸附比較強(qiáng)的話，就不容易流出。這樣就會(huì)發(fā)生，后面的點(diǎn)先出，而前面的點(diǎn)后出。這時(shí)可以采用氧化鋁作固定相。 

另外，收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就收到了三個(gè)樣品。如果都用小試管那工作量又太大。