簡介
離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質(zhì)交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學(xué)*域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學(xué)*域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。 基本原理
離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合上某種電荷基團形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團和平衡離子。電荷基團與高分子聚合物共價結(jié)合，形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結(jié)合于電荷基團上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。
其中R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)，X- 和X+ 分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結(jié)合的電荷基團，Y+ 和Y- 分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，A+ 和A- 分別代表溶液中的離子基團。 從上面的反應(yīng)式中可以看出，如果A離子與離子交換劑的結(jié)合力強于Y離子，或者提高A離子的濃度，或者通過改變其它一些條件，可以使A離子將Y離子從離子交換劑上置換出來。也就是說，在一定條件下，溶液中的某種離子基團可以把平衡離子置換出來，并通過電荷基團結(jié)合到固定相上，而平衡離子則進入流動相，這就是離子交換層析的基本置換反應(yīng)。通過在不同條件下的多次置換反應(yīng)，就可以對溶液中不同的離子基團進行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹離子交換層析的基本分離過程。
陰離子交換劑的電荷基團帶正電，裝柱平衡后，與緩沖溶液中的帶負電的平衡離子結(jié)合。待分離溶液中可能有正電基團、負電基團和中性基團。加樣后，負電基團可以與平衡離子進行可逆的置換反應(yīng)，而結(jié)合到離子交換劑上。而正電基團和中性基團則不能與離子交換劑結(jié)合，隨流動相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液，如增加離子強度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強度的增加，洗脫液中的離子可以逐步與結(jié)合在離子交換劑上的各種負電基團進行交換，而將各種負電基團置換出來，隨洗脫液流出。與離子交換劑結(jié)合力小的負電基團先被置換出來，而與離子交換劑結(jié)合力強的需要較高的離子強度才能被置換出來，這樣各種負電基團就會按其與離子交換劑結(jié)合力從小到大的順序逐步被洗脫下來，從而達到分離目的。各種離子與離子交換劑上的電荷基團的結(jié)合是由靜電力產(chǎn)生的，是一個可逆的過程。結(jié)合的強度與很多因素有關(guān)，包括離子交換劑的性質(zhì)、離子本身的性質(zhì)、離子強度、pH、溫度、溶劑組成等等。離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結(jié)合力的差異，并通過改變離子強度、pH等條件改變各種離子與離子交換劑的結(jié)合力而達到分離的目的。離子交換劑的電荷基團對不同的離子有不同的結(jié)合力。一般來講，離子價數(shù)越高，結(jié)合力越大；價數(shù)相同時，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越大。如陽離子交換劑對離子的結(jié)合力順序為：Li+ 蛋白質(zhì)等生物大分子通常呈兩性，它們與離子交換劑的結(jié)合與它們的性質(zhì)及pH有較大關(guān)系。以用陽離子交換劑分離蛋白質(zhì)為例，在一定的pH條件下，等電點pI pH的蛋白帶正電，能與陽離子交換劑結(jié)合，一般pI越大的蛋白與離子交換劑結(jié)合力越強。但由于生物樣品的復(fù)雜性以及其它因素影響，一般生物大分子與離子交換劑的結(jié)合情況較難估計，往往要通過實驗進行摸索。 離子交換劑的種類和性質(zhì) 1.離子交換劑的基質(zhì)
離子交換劑的大分子聚合物基質(zhì)可以由多種材料制成，聚苯乙烯離子交換劑（又稱為聚苯乙烯樹脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯為基質(zhì)。聚苯乙烯離子交換劑機械強度大、流速快。但它與水的親和力較小，具有較強的疏水性，容易引起蛋白的變性。故一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無機離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素（Cellulose）、球狀纖維素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、瓊脂糖（Sepharose）為基質(zhì)的離子交換劑都與水有較強的親和力，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，葡聚糖離子交換劑一般以Sephadex G－25和G－50為基質(zhì)，瓊脂糖離子交換劑一般以Sepharose CL－6B為基質(zhì)。關(guān)于這些離子交換劑的性質(zhì)可以參閱相應(yīng)的產(chǎn)品介紹。 2.離子交換劑的電荷基團
根據(jù)與基質(zhì)共價結(jié)合的電荷基團的性質(zhì)，可以將離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。
陽離子交換劑的電荷基團帶負電，可以交換陽離子物質(zhì)。根據(jù)電荷基團的解離度不同，又可以分為強酸型、中等酸型和弱酸型三類。它們的區(qū)別在于它們電荷基團完全解離的pH范圍，強酸型離子交換劑在較大的pH范圍內(nèi)電荷基團完全解離，而弱酸型完全解離的pH范圍則較小，如羧甲基在pH小于6時就失去了交換能力。一般結(jié)合磺酸基團（-SO3H），如磺酸甲基（簡寫為SM）、磺酸乙基（SE）等為強酸型離子交換劑，結(jié)合磷酸基團（-PO3H2）和亞磷酸基團（-PO2H）為中等酸型離子交換劑，結(jié)合酚羥基（-OH ）或羧基（-COOH），如羧甲基（CM）為弱酸型離子交換劑。一般來講強酸型離子交換劑對H離子的結(jié)合力比Na+離子小，弱酸型離子交換劑對H離子的結(jié)合力比Na+離子大。 #p#分頁標題#e#
陰離子交換劑的電荷基團帶正電，可以交換陰離子物質(zhì)。同樣根據(jù)電荷基團的解離度不同，可以分為強堿型、中等堿型和弱堿型三類。一般結(jié)合季胺基團（-N(CH3)3），如季胺乙基（QAE）為強堿型離子交換劑，結(jié)合叔胺（-N(CH3)2）、仲胺（-NHCH3）、伯胺（-NH2）等為中等或弱堿型離子交換劑，如結(jié)合二乙基氨基乙基（DEAE）為弱堿型離子交換劑。一般來講強堿型離子交換劑對OH?離子的結(jié)合力比Cl?離子小，弱酸型離子交換劑對OH?離子的結(jié)合力比Cl?離子大。3.交換容量
交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進行交換的能力。通常所說的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量，又稱為總交換容量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。在實際實驗中關(guān)心的是層析柱與樣品中各個待分離組分進行交換時的交換容量，它不僅與所用的離子交換劑有關(guān)，還與實驗條件有很大的關(guān)系，一般又稱為有效交換容量。后面提到的交換容量如未經(jīng)說明都是指有效交換容量。
影響交換容量的因素很多，主要可以分為兩個方面，一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進行作用的有效表面積。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當(dāng)然交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應(yīng)盡量能夠讓樣品組分進入，這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品，可以選擇較小孔隙的交換劑，因為小分子可以自由的進入孔隙，而小孔隙離子交換劑的表面積大于大孔隙的離子交換劑。對于較大分子樣品，可以選擇小顆粒交換劑，因為對于很大的分子，一般不能進入孔隙內(nèi)部，交換只限于顆粒表面，而小顆粒的離子交換劑表面積大。
另一些影響因素如實驗中的離子強度、pH值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。一般pH對弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對于弱酸型離子交換劑在pH較高時，電荷基團充分解離，交換容量大，而在較低的pH時，電荷基團不易解離，交換容量小。同時pH也影響樣品組分的帶電性。尤其對于蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在離子交換層析中要選擇合適的pH以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結(jié)合。一般來說，離子強度增大，交換容量下降。實驗中增大離子強度進行洗脫，就是要降低交換容量以將結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。
離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團的毫克當(dāng)量數(shù)（meq / mg或meq / ml）來表示。通?？梢杂傻味ǚy定。陽離子交換劑shou先用HCl處理，使其平衡離子為H+。再用水洗**中性，對于強酸型離子交換劑，用NaCl充分置換出H+，再用標準濃度的NaOH滴定生成的HCl，就可以計算出離子交換劑的交換容量；對于弱酸型離子交換劑，用一定量的堿將H+充分置換出來，再用酸滴定，計算出離子交換劑消耗的堿量，就可以算出交換容量。陰離子交換劑的交換容量也可以用類似的方法測定。
對于一些常用于蛋白質(zhì)分離的離子交換劑也通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質(zhì)的量來表示，一般這種表示方法對于分離蛋白質(zhì)等生物大分子具有更大的參考價值。實驗前可以參閱相應(yīng)的產(chǎn)品介紹了解各種離子交換劑的交換容量。
離子交換劑的選擇、處理和保存
1.離子交換劑的選擇
離子交換劑的種類很多，離子交換層析要取得較好的效果shou先要選擇合適的離子交換劑。
shou先是對離子交換劑電荷基團的選擇，確定是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑。這要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑；如帶負電，則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點為4，穩(wěn)定的pH范圍為6－9，由于這時蛋白帶負電，故應(yīng)選擇陰離子交換劑進行分離。強酸或強堿型離子交換劑適用的pH范圍廣，常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH下的分離。由于弱酸型或弱堿型離子交換劑不易使蛋白質(zhì)失活，故一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。
其次是對離子交換劑基質(zhì)的選擇。前面已經(jīng)介紹了，聚苯乙烯離子交換劑等疏水性較強的離子交換劑一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無機離子、氨基酸、核苷酸等。而纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等離子交換劑親水性較強，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。一般纖維素離子交換劑價格較低，但分辨率和穩(wěn)定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格適中，但受外界影響較大，體積可能隨離子強度和pH變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機械穩(wěn)定性較好，分辨率也較高，但價格較貴。
另外離子交換劑顆粒大小也會影響分離的效果。離子交換劑顆粒一般呈球形，顆粒的大小通常以目數(shù)（mesh）或者顆粒直徑（mm）來表示，目數(shù)越大表示直徑越小。前面在介紹交換容量時提到了一些關(guān)于交換劑顆粒大小、孔隙的選擇。另外離子交換層析柱的分辨率和流速也都與所用的離子交換劑顆粒大小有關(guān)。一般來說顆粒小，分辨率高，但平衡離子的平衡時間長，流速慢；顆粒大則相反。所以大顆粒的離子交換劑適合于對分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離，而小顆粒的離子交換劑適于需要高分辨率的分析或分離。 #p#分頁標題#e#
這里特別要提到的是，離子交換纖維素目前種類很多，其中以DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）和CM-纖維素（羧甲基纖維素）**常用，它們在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)，酶，核酸等）的分離方面顯示很大的優(yōu)越性。一是它具有開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多；二是它具有親水性，對蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。三是它的回收率高。所以離子交換纖維素已成為非常重要的一類離子交換劑。 2.離子交換劑的處理和保存
離子交換劑使用前一般要進行處理。干粉狀的離子交換劑shou先要進行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團充分暴露出來。而后用水懸浮去除雜質(zhì)和細小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗**中性，再用另一種試劑處理，**后再用水洗**中性，這是為了進一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為Na型（即平衡離子是Na離子），陰離子交換劑為Cl型，因為通常這樣比較穩(wěn)定。處理時一般陽離子交換劑**后用堿處理，陰離子交換劑**后用酸處理。常用的酸是HCl，堿是NaOH或再加一定的NaCl，這樣處理后陽離子交換劑為Na型，陰離子交換劑為Cl型。使用的酸堿濃度一般小于0.5 mol / L，浸泡時間一般30 min。處理時應(yīng)注意酸堿濃度不宜過高、處理時間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。
離子交換劑的再生是指對使用過的離子交換劑進行處理，使其恢復(fù)原來性狀的過程。前面介紹的酸堿交替浸泡的處理方法就可以使離子交換劑再生。離子交換劑的轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種平衡離子轉(zhuǎn)為另一種平衡離子的過程。如對陰離子交換劑用HCl處理可將其轉(zhuǎn)為Cl型，用NaOH處理可轉(zhuǎn)為OH型，用甲酸鈉處理可轉(zhuǎn)為甲酸型等等。對離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型的目的是一致的，都是為了使離子交換劑帶上所需的平衡離子。
前面已經(jīng)介紹了，離子交換層析就是通過離子交換劑上的平衡離子與樣品中的組分離子進行可逆的交換而實現(xiàn)分離的目的，因此在離子交換層析前要注意使離子交換劑帶上合適的平衡離子，使平衡離子能與樣品中的組分離子進行有效的交換。如果平衡離子與離子交換劑結(jié)合力過強，會造成組分離子難以與交換劑結(jié)合而使交換容量降低。另外還要保證平衡離子不對樣品組分有明顯影響。因為在分離過程中，平衡離子被置換到流動相中，它不能對樣品組分有污染或破壞。如在制備過程中用到的離子交換劑的平衡離子是H或OH離子，因為其它離子都會對純水有污染。但是在分離蛋白質(zhì)時，一般不能使用H或OH型離子交換劑，因為分離過程中H或OH離子被置換出來都會改變層析柱內(nèi)pH值，影響分離效果，甚**引起蛋白質(zhì)的變性。
離子交換劑保存時應(yīng)shou先處理洗凈蛋白等雜質(zhì)，并加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，一般加?.02 %的疊氮鈉，4℃下保存。 離子交換層析的基本操作
離子交換層析的基本裝置及操作步驟與前面介紹的柱層析類似，這里就不再重復(fù)了。下面主要介紹離子交換層析操作中應(yīng)注意的一些具體問題。 1.層析柱
離子交換層析要根據(jù)分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。直徑和柱長比一般為1:10到1:50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時要均勻平整，不能有氣泡。 2.平衡緩沖液
離子交換層析的基本反應(yīng)過程就是離子交換劑平衡離子與待分離物質(zhì)、緩沖液中離子間的交換，所以在離子交換層析中平衡緩沖液和洗脫緩沖液的離子強度和pH的選擇對于分離效果有很大的影響。平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強度和pH的選擇shou先要保證各個待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。其次是要使各個待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。一般是使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合。而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定。在一些情況下（如污水處理）可以使雜質(zhì)與離子交換劑有牢固的結(jié)合，而樣品與離子交換劑結(jié)合不穩(wěn)定，也可以達到分離的目的。另外注意平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強的離子，否則會大大降低交換容量，影響分離效果。選擇合適的平衡緩沖液，直接就可以去除大量的雜質(zhì)。并使得后面的洗脫有很好的效果。如果平衡緩沖液選擇不合適，可能會對后面的洗脫帶來困難，無法得到好的分離效果。 3.上樣
離子交換層析的上樣時應(yīng)注意樣品液的離子強度和pH值，上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的1－5%為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。 4.洗脫緩沖液
在離子交換層析中一般常用梯度洗脫，通常有改變離子強度和改變pH兩種方式。改變離子強度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個組分被洗脫下來；而改變pH的洗脫，對于陽離子交換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH從高到低。由于pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強度的梯度洗脫。梯度洗脫的裝置前面已經(jīng)介紹了，可以有線性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分級梯度等洗脫方式。一般線性梯度洗脫分離效果較好，故通常采用線性梯度進行洗脫。 #p#分頁標題#e#
洗脫液的選擇shou先也是要保證在整個洗脫液梯度范圍內(nèi)，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。其次是要使結(jié)合在離子交換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內(nèi)都能夠被洗脫下來。另外可以使梯度范圍盡量小一些，以提高分辨率。 5.洗脫速度
洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會造成分離時間長、樣品擴散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中某個區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。 6.樣品的濃縮、脫鹽
離子交換層析得到的樣品往往鹽濃度較高，而且體積較大，樣品濃度較低。所以一般離子交換層析得到的樣品要進行濃縮、脫鹽處理。 離子交換層析的應(yīng)用 離子交換層析的應(yīng)用范圍很廣，主要有以下幾個方面。 1.水處理
離子交換層析是一種簡單而有效的去除水中的雜質(zhì)及各種離子的方法，聚苯乙烯樹脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。純水的制備可以用蒸餾的方法，但要消耗大量的能源，而且制備量小、速度慢，也得不到高純度。用離子交換層析方法可以大量、快速制備高純水。一般是將水依次通過H+ 型強陽離子交換劑，去除各種陽離子及與陽離子交換劑吸附的雜質(zhì)；再通過OH- 型強陰離子交換劑，去除各種陰離子及與陰離子交換劑吸附的雜質(zhì)，即可得到純水。再通過弱型陽離子和陰離子交換劑進一步純化，就可以得到純度較高的純水。離子交換劑使用一段時間后可以通過再生處理重復(fù)使用。 2.分離純化小分子物質(zhì)
離子交換層析也廣泛的應(yīng)用于無機離子、有機酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。例如對氨基酸的分析，使用強酸性陽離子聚苯乙烯樹脂，將氨基酸混合液在pH 2~3上柱。這時氨基酸都結(jié)合在樹脂上，再逐步提高洗脫液的的離子強度和pH，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，可以進行分離鑒定。目前已有全部自動的氨基酸分析儀。 3.分離純化生物大分子物質(zhì)
離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來進行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。由于生物樣品中蛋白的復(fù)雜性，一般很難只經(jīng)過一次離子交換層析就達到高純度，往往要與其它分離方法配合使用。使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質(zhì)來分離的特性，只要選擇合適的條件，通過離子交換層析可以得到較滿意的分離效果
