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柱層析

柱層析的基本操作 
柱層析的基本操作 
柱層析的基本操作包括以下一些步驟: ⑴ 裝柱 
柱子裝的質(zhì)量好與差,是柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻,不能分層,柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。 
shou先選好柱子,根據(jù)層析的基質(zhì)和分離目的而定。一般柱子的直徑與長度比為1:10~50;凝膠柱可以選1:100~200,同時將柱子洗滌干凈。 
將層析用的基質(zhì)(如吸附劑、樹脂、凝膠等)在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹,并用適當(dāng)濃度的酸(0.5N~1N)、堿(0.5N~1N)、鹽(0.5M~)溶液洗滌處理,以除去其表面可能吸附的雜質(zhì)。然后用去離子水(或蒸餾水)洗滌干凈并真空抽氣(吸附劑等與溶液混合在一起),以除去其內(nèi)部的氣泡。  
關(guān)閉層析柱出水口,并裝入1/3柱高的緩沖液,并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中,使其沉降約高。 
打開出水口,控制適當(dāng)流速,使吸附劑等均勻沉降,并不斷加入吸附劑溶液。(吸附劑的多少根據(jù)分離樣品的多少而定。)注意不能干柱、分層,否則必須重新裝柱。 
**后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有2~高的緩沖液,同時關(guān)閉出水口。(采用機械化裝柱法在此省略。) ⑵ 平衡 
柱子裝好后,要用所需的緩沖液(有一定的pH和離子強度)平衡柱子。用恒流泵在恒定壓力下走柱子(平衡與洗脫時的壓力盡可能保持相同)。平衡液體積一般為3~5倍柱床體積,以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。如果需要,可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱,如色帶均勻下降,則說明柱子是均勻的。有時柱子平衡好后,還要進行轉(zhuǎn)型處理。這方面的內(nèi)容在離子交換層析中加以介紹。 ⑶ 加樣 
加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講,加樣量盡量少些,分離效果比較好。通常加樣量應(yīng)少于20%的操作容量,體積應(yīng)低于5%的床體積,對于分析性柱層析,一般不超過床體積的1%。當(dāng)然,**大加樣量必須在具體條件下多次試驗后才能決定。 
應(yīng)注意的是,加樣時應(yīng)緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面,盡量避免沖擊基質(zhì),以保持基質(zhì)表面平坦。詳細操作見層析實驗。 ⑷ 洗脫 
當(dāng)我們選定好洗脫液后,洗脫的方式可分為簡單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。 
簡單洗脫:柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫,直到層析分離過程結(jié)束為止。如果被分離物質(zhì)對固定相的親合力差異不大,其區(qū)帶的洗脫時間間隔(或洗脫體積間隔)也不長,采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數(shù)較大。否則應(yīng)采用下面的方法。  
分步洗脫:這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液,進行逐級洗脫。它主要對混合物組成簡單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離時適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。梯度洗脫:當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時,一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的,梯度可以指濃度、極性、離子強度或pH值等。**常用的是濃度梯度。在水溶液中,亦即離子強度梯度??尚纬商荻鹊男问接腥N,如圖3-4 所示(以鹽濃度梯度為例): 
 
我們可以通過下式計算得到流經(jīng)層析柱的洗脫液中鹽濃度的計算公式:  
C = CB - ( CB - CA ) ( 1 - V2 / V1 )B1 / A1   
式中: C :流經(jīng)層析柱的洗脫液的鹽濃度 CB :梯度混合器中B 瓶的鹽濃度(不攪拌) CA :梯度混合器中A 瓶的鹽濃度(攪拌) B1 :B 瓶的橫切面積 A1 :A 瓶的橫切面積 
V2 :流經(jīng)層析柱的洗脫液體積 V1 :梯度洗脫液總體積  
 
洗脫條件的選擇,也是影響層析效果的重要因素。當(dāng)對所分離的混合物的性質(zhì)了解較少時,一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試,但梯度的斜率要小一些,盡管洗脫時間較長,但對性質(zhì)相近的組分分離更為有利。同時還應(yīng)注意洗脫時的速率。前面我們已經(jīng)談到,流速的快慢將影響理論塔板高度,從而影響分辨率。事實上,速度太快,各組分在固液兩相中平衡時間短,相互分不開,仍以混合組分流出。速度太慢,將增大物質(zhì)的擴散,同樣達不到理想的分離效果。只有多次試驗才會得到合適的流速??傊?,我們必須經(jīng)過反復(fù)的試驗與調(diào)整(可以用正交試驗或優(yōu)選法),才能得到**佳的洗脫條件。還應(yīng)強調(diào)的一點是,在整個洗脫過程中,千萬不能干柱,否則分離純化將會前功盡棄。 ⑸ 收集、鑒定及保存 
在生化實驗中,基本上我們都是采用部分收集器來收集分離純化的樣品。由于檢測系統(tǒng)的分辨率有限,洗脫峰不一定能代表一個純凈的組分。因此,每管的收集量不能太多,一般1ml-5ml / 管。如果分離的物質(zhì)性質(zhì)很相近,可低**0.5ml / 管。這視具體情況而定。在合并一個峰的各管溶液之前,還要進行鑒定。例如,一個蛋白峰的各管溶液,我們要先用電泳法對各管進行鑒定。對于是單條帶的,認為已達電泳純,合并在一起。其他的另行處理。對于不同種類的物質(zhì)采用相應(yīng)的鑒定方法,在這里不再敘述。**后,為了保持所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性與生物活性,我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮,再冰凍干燥,得到干粉,在低溫下保存?zhèn)溆谩?/div>
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