1. 組合柱層析色譜法、HPLC分析
Li Rui[1]等 X-5樹脂和Sephadex LH-20結合的方法從V. uliginosum berry里分離純化得到11種花青素和兩種多酚。具體操作方法：25 mL提取液過X-5樹脂（乙醇，0.5%TFA處理），然后用0.5 % TFA (v/v)去離子水沖洗2次去除多糖，有機酸等水溶性雜質；接著多酚由乙酸乙酯洗脫回收，0.5% TFA (v/v)乙醇洗脫4次回收得到花青素。濃縮得到的花青素采用Sephadex LH-20色譜柱進一步純化，采用含有 0.5% TFA的30%乙醇水溶液為洗脫溶劑。洗脫下來的片段采用分光光度法在525nm處檢測。每部分洗脫液在35 oC真空下旋轉蒸發（RE-52AA, Yarong, Shanghai, China) **干燥，然后再用0.5% TFA (v/v) 溶液溶解，分析前-20 o
C下保存。分析方法為HPLC–DAD-ESI-MS 和MS/MS
**二雷[2]等也分別采用組合層析和半制備型高效液相色譜的方法從野生藍莓中分離得到高純度的花青素混合物和單體。利用 UV-vis 和高效液相色譜對花青素含量進行檢測，利用 HPLC 和 HPLC-DAD-ESI-MS/MS 對純化樣品中的花青素進行種類鑒定。
shou先，將野生藍莓粗提液用乙酸乙酯萃取4次，將萃取之后的水相上
Amberlite XAD-7HP (20–60目， Sigma-Aldrich)陽離子交換柱（2.6 cm?50 cm）。然后用2 L含0.01% HCl 的去離子水以1 mL/min的流速沖洗柱子，以去大部分的除多糖，有機酸，蛋白和離子。用1 L 35%的酸化乙醇溶液（0.01% HCl）做為洗脫液，流速為1.5 mL/min進行洗脫。根據柱中顏色邊界層以及在520 nm處的UV-vis檢測結果進行洗脫液的收集，再濃縮（不超過40 oC），冷凍干燥制得花青素粗提物。用300 mL 60–80% 乙醇溶液 (0.01% HCl)將弱極性的花青素和其他酚類進行完全洗脫，備用。
然后，取0.1 g 經上一步樹脂純化的色素粗提物用20 mL去離子水溶解，上Sephadex LH-20層析柱（1.0 cm × 60 cm; Sigma Chemical Co., St. Louis,MO, USA），用1 L 25% 乙醇溶液(0.01%HCl)以1.2 mL/min的流速洗脫，并用10 mL試管收集洗收集不同組分，分別濃縮、冷凍干燥制得藍莓花青素純化樣品。
**后，為了得到花青素的單體，將LH-20分離得到的各部分樣品經半制備型高效液相色譜進一步純化，得到高純度的花青素單體。
研究優點：此采用采用乙醇，乙酸乙酯，鹽酸等無毒或低毒溶劑，取代了常規的劇毒有機溶劑比如甲醇，丙酮，三氟乙酸等。
同樣的Giuliana Catalano[3]， Luis Cabrita[4]， Zhaoqi Zhang[5]等人也采用Amberlite XAD-7樹脂和Sephadex LH-20柱層析的方法分別從毛野豌豆的花瓣、藍莓和荔枝果皮中分離得到花青素；**峰[6]采用柱層析法對黑花生衣色素進行分離純化，方法流程為：黑花生衣→50%甲醇(含0.1%三氟醋酸)浸提→濃縮→乙酸乙酯萃取→脫有機溶劑→XAD-7HP大孔樹脂純化→聚酰胺純化→葡聚糖凝膠LH-20純化→得到兩種色素單體；Gary R. Takeoka[7]等從黑豆中用固相萃取（硅藻土）和制備型HPLC法分離得到了3種花青素。 2. 高速逆流色譜和柱層析結合法
Andreas[8]等人采用Amberlite XAD-7樹脂和高速逆流層析（HSCCC）的方法從玫瑰茄，紫甘藍，黑醋栗，黑果梨等中分離得到多種花青素，并對其抗氧化性能進行測試篩選。具體過程為：先用Amberlite XAD-7層析柱 (50 cm*4 cm, Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) 對花青素粗提液進行初步純，洗脫液組成為甲醇/乙酸(19:1, v/v)。洗脫液在真空下濃縮，然后冷凍干燥保存。接著采用高速逆流色譜進一步純化，高速逆流色譜設備配備3個串聯的制備線圈（d=2.6 mm, V= 850 mL），轉速為1000 rpm，所用的溶劑體系組成為叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水（2:2:1:5），并用三氟乙酸酸化，流速為5 mL/min，之前冷凍干燥的花青素產品用1:1體系的輕相和重相溶解，由環式注射器進樣。HPLC-DAD, TLC, ESI-MS/MS和1H NMR分析方法用來檢測分離的花青素的純度及分子式。
Koichi[9]等建立了一套高速逆流色譜分離方法實現了花青素的純化分離。 兩相溶劑系統的優選。
Bo Li[10]等采用高速逆流色譜和C18反向色譜連用的方法從黑米中分離得到純度高達94.38% 的Cyanidin-3-O--d-glucoside花青素。 具體方法：
（1）LC–UV–MS/MS( LC/MSD trap----Liquid Chromatography/Mass Spectrometer Detector ion trap) 液相色譜/質譜聯用儀離子阱方法鑒定花青素種類，設備：Agilent 1100 series（Palo Alto, CA, USA）配備ESI（electrospray ionization source）電噴射粒子化器和一個DAD(diode-array detector)二極管陣列檢測器；所用分離柱材料為YMC ODS-AQ 柱 (3 ?m, 150 mm×4.6 mm i.d., Kyoto, Japan). 流動相A為甲酸/(8.5:91.5, v/v)，B相甲酸/甲醇/乙腈/水(8.5:22.5:22.5:41.5, v/v/v/v)。
（2）HPLC法對高速逆流色譜兩相溶劑系統的優選。根據分配系數（K）所用兩相溶劑系統的組成為：水-正丁醇-叔丁基甲基醚-乙腈-三氟乙酸。**佳比例根據分配系數K和固定相的保留比例確定。
（3）經高速逆流分離得到的產品進一步用反向C18色譜進一步純化，得到花青素單體。YMC PACK ODS-AQ C18 column (50 ?m, 50 cm×3 cm i.d.)， 洗脫劑為含0.1% TFA的22%甲醇，流速為2 mL/min。（4）**后再由核磁的碳普氫普確認所分離物質。
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